解析IVD领域七大创新技术
在IVD(体外诊断)行业中，创新技术是推动行业发展的关键力量。目前主流的IVD领域创新技术主要包括三代测序技术、数字 PCR、流式液相芯片、单分子免疫检测、微流控技术、光激化学发光技术、质谱检测技术。 以下是对这些创新技术的梳理和总结。
一、三代测序技术
三代测序技术，也被称为单分子测序技术或从头测序技术，其最大的特点是实现了对每一条DNA分子的单独测序，且测序过程无需进行PCR扩增，从而避免了潜在的PCR扩增错误和偏好性。
1.1 技术原理
三代测序技术的原理主要分为两大技术阵营：
单分子荧光测序
代表性技术包括美国螺旋生物(Helicos)的SMS技术和美国太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技术。
技术原理：脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链时，其荧光能被探测到，并与DNA链形成化学键后，荧光基团被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，且合成的DNA链与天然DNA链一致。
关键技术：如Pacific Biosciences公司发明的零模波导孔技术(Zero-Mode Waveguides，ZMWs)，使得光只能照亮固定了单个DNA聚合酶/模板分子的纳米孔底部，从而实现对单分子的精确测序。
纳米孔测序：
代表性公司为英国牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore Technologies)。
技术原理：采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而不同碱基(ATCG)的带电性质不一样，因此通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。
1.2 技术特点
长读长：三代测序技术能够实现超长读长，如PacBio的SMRT技术平均读长可达10,000 bp，最长读长超过20,000 bp，这有助于减少后续的基因组拼接和注释的工作量。
高精度：测序精度非常高，达到99.9999%，能够准确检测DNA分子的序列信息。
直接测序：能够直接测序原始DNA和RNA，无需进行PCR扩增，保留了原始碱基修饰信息，如甲基化等。
实时测序：能够实时获得序列信息，满足动态检测宏基因组的需求。
1.3 应用领域
三代测序技术主要用于基因组测序、甲基化研究和突变鉴定等方面。在基因组测序方面，由于其具有长读长的特点，能够降低测序后的Contig数量，减少后续的基因组拼接和注释的工作量。在甲基化研究方面，SMRT技术能实时监测DNA聚合酶的工作状态，聚合酶合成每一个碱基都有一个时间段，当模板碱基带有修饰时，聚合酶会慢下来，带有修饰的碱基两个相邻的脉冲峰之间的距离和参考序列的距离之间的比值结果大于1，就可以推断这个位置有修饰。在突变鉴定方面，单分子测序的分辨率具有不可比拟的优势，而且没有PCR扩增步骤，就没有扩增引入的碱基错误
二、数字PCR
数字PCR(Digital PCR, dPCR)是一种高灵敏度的核酸分子绝对定量技术，它在近年来得到了广泛的发展和应用。
2.1 技术原理
数字PCR是一种通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增，并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析的技术。其基本原理是将一个样本分成几十到几万份，然后分配到不同的反应单元中，每个单元包含一个或多个拷贝的核酸分子(即DNA模板)，每个单元都会对目标分子进行扩增，然后再对每个单元进行荧光信号的统计并计算。相较于传统PCR技术，数字PCR不依赖于标准曲线，具有更高灵敏度、准确度及高耐受性，可实现对样品的绝对定量分析。
2.2 技术特点
绝对定量：数字PCR能够直接读出DNA的分子个数，对起始样本核酸分子进行绝对定量，不依赖于扩增曲线循环Ct值，也不受扩增效率的影响。
高灵敏度：数字PCR将传统PCR反应体系分割成数万个独立PCR反应，可以精确地检测很小的目的片段差异、单拷贝甚至低浓度的混杂样本。
高耐受性：由于目的序列被分配到多个独立反应体系中，显著降低了背景信号和抑制物对反应的干扰，扩增基质效应大大减小。
多样化的样本稀释分配方式：目前数字PCR样本稀释分配的方式主要有三种：基于大规模集成微流控芯片、使用微反应室/孔板、微滴式。其中，微滴式dPCR(droplet dPCR, ddPCR)和芯片式dPCR(chip dPCR, cdPCR)是市面上常见的两种技术。
2.3 应用领域
数字PCR特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域，如拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。此外，数字PCR还在单细胞分析、癌症早期诊断等领域展现出巨大的应用潜力。
2.4 发展历程
数字PCR的概念最早在20世纪末由Vogelstein等提出，经过几十年的发展，目前全球已有超过30家相关企业致力于数字PCR技术的研发和应用。从1987年第一代PCR系统开启商用，到2006年第一款商业化数字PCR系统Biomark HD发布，再到近年来各平台频繁发布新品，数字PCR技术不断迭代升级，推动了其在临床和科研领域的广泛应用。
三、流式液相芯片
流式液相芯片技术，也称为流式荧光技术或液相悬浮技术，是一种基于微球体(或称为微珠)的生物检测技术。该技术通过在微球表面固定上特定的生物探针(如抗体、核酸等)，与待测样本中的目标分子进行特异性结合，并通过流式荧光技术实现高通量、快速检测。
3.1 技术原理
流式液相芯片技术的核心在于编码微球和流式荧光检测。编码微球直径约为5.5～5.6μm，表面涂覆有荧光物质，内部则含有特定浓度的荧光染料。不同的微球通过荧光染料的不同组合进行编码，从而实现对不同目标分子的识别。当微球与样本中的目标分子结合后，通过激光扫描检测荧光信号的变化，即可实现对目标分子的定量和定性分析。
流式荧光检测则是利用荧光标记的探针与待测样本中的目标分子进行特异性结合，并通过流式细胞仪对微球进行快速、连续的检测。在流式细胞仪中，微球被特定的流动系统驱动，逐个通过检测区域。当微球经过激光束时，荧光标记的探针会发出特定的荧光信号，这些信号被光电倍增管等光电器件接收并转化为电信号，进而通过计算机进行数据处理和分析。
3.2 技术特点
高通量：流式液相芯片技术可以同时检测同一样本中的多种不同目标分子，大大提高了检测效率。例如，Luminex液相悬浮芯片技术最多可一管同时准确定量检测2-500种不同的生物分子。
高灵敏度：该技术能够检测到极低浓度的生物分子，最低检测浓度可达到2 pg/ml甚至更低(如Luminex技术的下限达0.1pg/mL)，使得检测结果更加准确可靠。
操作简便：流式液相芯片技术采用自动化操作流程，减少了人为操作误差，提高了检测精度。
检测线性范围广：该技术能够覆盖较宽的浓度范围，满足不同样本的检测需求。
3.3 技术发展
液相芯片技术是迄今为止被美国食品药品管理局(FDA)惟一批准用于临床诊断的生物芯片技术。这一认证标志着液相芯片技术在临床应用中的安全性和有效性得到了权威机构的认可。到2005年，全球已有近200个液相芯片项目获得了FDA认证。其中，美国Luminex公司和荷兰的QIAGEN跨国公司是液相芯片技术的领先企业，为全球提供了先进的检测平台。在国内，液相芯片技术也得到了快速发展。国内厂家已生产了配套的自动加样仪系统，实现了全自动化检测。同时，也有多家企业推出了商品化的液相芯片检测试剂，如上海透景公司生产的肿瘤标志物检测产品、HPV检测产品等。
四、单分子免疫检测
单分子免疫检测是一种在蛋白质生物标志物检测领域具有突破性意义的新技术。
4.1 技术定义
单分子免疫检测技术(如Single Molecule Counting, SMC™;single molecule array, SiMoA等)是一种通过对溶液中特定种类的单个分子进行检测和统计，从而实现对溶液浓度进行定量检测的方法。这种技术能够直接计数单个抗原分子，实现定量检测分析，从检测原理上打破了现有发光体系检测灵敏度的瓶颈。
4.2 技术原理
单分子免疫检测技术的主流平台如Erenna、SiMoA等，通常利用免疫标记的方法，通过抗体捕获和识别抗原，进行信号分子标记或是酶联标记的形式，然后通过单分子荧光信号检测或单分子酶促反应实现的单分子级别蛋白分子的检测。其中，以Erenna平台为例，其利用毛细管进行免疫荧光标记分子的上样，并以激光聚焦的方式进行激发检测。当荧光素标记分子通过高能量的激光焦点时，荧光素所发射的光闪烁信号被检测器测得。光闪烁信号的次数和强度与分子浓度呈正相关性，从而能建立标准曲线，通过对一定时间之内光闪烁信号进行统计，可以对溶液浓度进行定量检测。
4.3 主要特点
超高检测灵敏度：单分子免疫检测技术的灵敏度远超传统的ELISA技术，可达到ELISA的约1000倍，成功实现浓度在fmol级别蛋白靶标的检测。这种高灵敏度使得检测超低丰度蛋白成为现实。
宽动态检测范围：该技术具有宽至4个log的大动态检测范围，有利于蛋白靶标表达量存在巨大差异的样本进行同时检测。
灵活的实验方案：可根据靶标丰度和成本灵活选择实验方案，既可使用磁珠又可使用普通96孔板作为抗体包被介质，在灵敏度和成本方面取得了巧妙平衡。
便于自行开发检测试剂盒：如果检测的是全新的标志物，商业化的整套试剂盒开发工具，可在极短时间内开发新检测试剂盒。
全自动化与高精度：实验过程不依赖操作人员，从而保证结果的重复性和精准性。实验结果的批间变异系数(CVS)低于10%。
4.4 技术发展
随着技术的不断发展和完善，单分子免疫检测技术也在不断优化和更新。例如，Quanterix公司的SiMoA技术通过微阵列芯片实现单分子免疫检测，其检测限可达飞摩尔(fg/mL)数量级，是目前最具代表性的单分子免疫检测技术之一。此外，国内也有企业致力于开发并产业化更适合于临床转化应用的新型单分子免疫检测系统，通过创新的单分子检测技术的突破，显著降低了检测技术路径的复杂程度、检测成本，提高了检测通量、检测效率和检测的稳定性。
来源于分子诊断实验室 ，作者研发小智
